Снимка предоставена от iStockphoto

Фред Енгелбрехт и Томас Венд от научната лаборатория ExploHeidelberg описват няколко експеримента върху отчитането на кръвната захар за да ни представят проблемите, пред които всеки ден са изправени хората с диабет.

Диабетът – болест на модерното общество

Моноцахаридът глюкоза е най-важният източник на енергия за живите еукариотни организми и се използва от клетките при аеробното и анаеробното дишане. Служи също и като суровина при синтеза на протеини и в метаболизма на липиди. Следователно е и основна молекула в някои метаболитни пътища и концентрацията му в кръвта е необходимо строго да се регулира чрез инсулин и глюкагон.

Diabetes mellitus (или просто диабет) е синдром, характеризиращ се с нарушен метаболизъм на глюкозата и много високи нива на кръвната захар (хипергликемия). Дължи се на ниските нива на хормона инсулин или на неестествена резистентност към инсулина, придружена с твърде ниски нива на секреция за компенсиране на резистентността.

Съществуват две основни форми на диабет: тип 1 и тип 2. Въпреки че причините за двата типа са различни, пациентите и при двата не могат да произвеждат достатъчно инсулин в бета клетките на панкреаса за да предотвратят хипергликемията.

Диабет тип 1 засяга 10% от болните от диабет в Европа и се характеризира със загуба на бета клетки от панкреаса, причинено обикновено от автоимунно заболяване. Тъй като тип 1 се среща обикновено при млади пациенти, е наречен още младежки диабет. Той е най-агресивната форма на болестта, тъй като за него не съществува лечение. Затова пациентите се приспособяват за живот с него, като променят структурата на дневния си прием на храна, редовно правят физически упражнения и следят нивото на кръвната си захар. Освен това подкожните инжекции или непрекъснатото подаване на инсулин чрез помпа в кръвоносната система са необходими за да се избегне кома и смърт.

Диабет тип 2се дължи на инсулинова резистентност или намалена чувствителност към инсулин в определени тъкани, в комбинация с намалена инсулинова секреция. Занижената реакция на тъканите към инсулин почти сигурно се дължи на инсулиновите рецептори, разположени в клетъчните мембрани. Това води до необходимост от изключително високи количества инсулин за подържане на нормалните нива на кръвна захар, а диабетът се развива при недостатъчото производство от страна на бета клетките. Тип 2, известен още като възрастов диабет, се появява след 30-тата година. В повечето случаи се дължи на наднормено тегло и слабо физическо натоварване, а преминаването към активен начин на живот може да подобри състоянието им, а в отделни случаи дори да ги излекува. Виж Dugi (2006) за повече информеция.

Болните и от двата типа диабет трябва да се научат да живеят със симптомите на болестта. Те включват често уриниране, жажда, а в резултат н атова повишен прием на течности. Тъй като броят на болните от диабет деца е голям, важно е учениците да бъдат запознати с болестта от ранна възраст. Страдащите от диабет трябва да се научат да минимизират симптомите и дори да ги избягват чрез здравословно хранене и достатъчно физически упражнения. Здравите деца трябва да разбират нуждите на своите засегнати от болестта приятели.

Снимка предоставена от iStockphoto

Затова сме избрали няколко опита, в които учениците откриват въглихидратите. В първата серия учениците проверяват дали в разтвора се съдържат скорбяла, протеини или захари като глюкоза, лактоза, захароза. След установяването на наличие, следваща група от експерименти установява кои проби съдържат лактоза или глюкоза посредством ензимна реакция. Принципът на тези експерименти е същият като при тестовете за установяване на нивото на кръвната захар при диагностика на диабет или измерването на нивото на глюкозата и/или лактозата в плодовите сокове, млякото или млечните продукти. Затова тези експерименти дават представа на учениците как диабетиците измерват нивото на кръвната си захар.

Експеримент 1: Откриване на захар, скорбяла и протеин

Учениците разполагат с пет проби, означени с букви от А до Е, които съдържат съответно скорбяла, протеин (говежди серумен албумин), монозахарида глюкоза или дизахаридите лактоза или захароза. Всички разтвори са водни с концентрация 0,1%. Можете да използвате и проба от безцветна глюкозо-съдържаща енергийна напитка. Като използват разтвори на различни реагенти, учениците трябва да определят коя от петте проби съдържа захар, нишесте или протиен.

За клас от 30 ученици се нуждаете от следните разтвори:

• Пресен разтвор на Фелингов реактив, който се получава при смесване на равни части от светлосиният Фелинг І (7 g CuSO₄·5H₂O , разтворен в 100 ml дестилирана вода) и безцветният Фелинг ІІ (35 g C₄H₄KNaO₆·4H₂O и 10 g NaOH , разтворени в 100 ml дестилирана вода). Разтворът трябва да се подготви малко преди занятието.


• Луголов разтвор, който се получава при разтварянето на 1 g йод (I₂) и 2 g калиев йодид (KI) в 50 ml дестилирана вода.


• Ярко синьо Кумаси за Брадфорд протеиновия тест от Biorad^w1.

a) Установяване наличие на редуцирана захар (Реакция на Фелинг)

1. С пипета се пренася по 1 ml от разтвори А до Е в 5 различни колби и се загрява до 60 °C на водна баня за 2 min.
2. Добавя се по 16 μl пресен тъмно син Фелингов разтвор към всяка колба и колбите се загряват до 60 °C за още 10 min или до появата на цветна реакциа и образуването на преципитат.

Разтворите, съдържащи редуцирана захар като фруктоза, глюкоза или лактоза трябва да станат червени и да се образува преципитат (разтворимите йони на медта (ІІ) се редуцират да меден (І) оксид), докато в разтвора с със захароза или скорбяла цветна реакция не протича. Разтворът на протеин се оцветява в бледо виолетово.

b) Установяване на скорбяла

1. С пипета се пренася по 500 μl от разтвори А до Е в 5 нови различни колби.
2. Добавя се по 50 μl Луголов разтвор към всяка колба и се наблюдава цветната реакция.

Луголовият разтвор е индикатор за наличие на скорбяла. Той оцветява скорбялата в тъмно синьо при взаимодействието си с верижната структура на полизахарида. Не би реагирал с моно захарида (глюкоза) или с дизахаридите (лактоза или захароза).

c) Установяване на протиеин

Протеиновият тест се основава на оцветителя на Брадфорд, където се измерва интензивността на оцветяването с ярко синьо Кумаси при взаимодействието му с протеина.

1. С пипета се пренася по 20 μ от разтвори от А до Е в 5 нови различни колби, след което се добавя 800 μl дейонизирана вода и 200 μl ярко синьо Кумаси (реагент на Брадфорд).
2. Смесете реагентите и след 5 min наблюдавайте цветната реакция.

При наличие на протеин, разтворът ще се оцвети в синьо (може да се отчете с фотометър на 595 nm). Пробите със скорбяла или захар не променят цвета си.

Мярка за безопасност: Протеиновият тест съдържа метанол и фосфорна киселина и затова с тях трябва да се работи внимателно.

Реакция с Фелигов реактив (вляво), с Луголов реактив (в средата), протеинов тест (вдясно)
Снимка, предоставена от Thomas Wendt

Резултати и изводи

базтвор В дава положителна реакция с Луголов реактив, което означава, че разтворът съдържа скорбяла. Разтвор D дава положителна реакция с тест на Брадфорд като по този начин става ясно, че е протеинов разтвор. Разтвори A и C дават червен преципитат при Фелингова реакция и затова могат да бъдат определени като проби, съдържащи редуцираните захари глюкоза и лактоза (въпреки че на този етап не може да се определи коя проба каква е). Оставащият разтвор Е не показва реакция при тестовете и затова се определя като разтвор на захароза.

Експеримент 2: Ензимно определяне на кръвната захар

Във втория експеримент се тестват двата разтвора А и С за да се определи кой е лактоза и кой е глюкоза. За този експеримент използваме готов комплект EnzyPlus EZS 962+ лактоза/D-глюкоза, който може да бъде закупен от BioControl^w2. Процедурата е подобна на тази, използвана всеки ден от диабетиците за следене на нивата на кръвната захар. Стандартният метод за работа с продукта продукта е променен и адаптиран с цел провеждането на повече опити с наличните реагенти. Един комплект съдържа материали за работа на 20 двойки ученици.

Принципът на опита е както следва (вижте фигурите):

• Дизахаридът лактоза се хидролизира от ензима β-галагтозидаза до D-галактози и D-глюкоза. (етап 1).


• В присъствието на АТФ D-глюкозата се фосфолизира от хексокиназата до глюкозо-6-фосфат; в същото време се образува аденозин-5’-дифосфат (АДФ) (етап 2).


• Глюкозо-6-фосфатът се окислява от глюкозо-6-фосфат дехидрогеназата до глюконат-6-фосфат.


• По време на реакцията НАДФ⁺ се редуцира до НАДФ.Н. Количеството НАДФ.Н, образувано по време на реакцията е стехиометрично на количеството лактоза и може да бъде измерено фотометрично чрез повишаване на абсорвцията при 340 nm.

Етап 2: Установяване на глюкоза
Снимка предоставена от Thomas Wendt

За провеждане на опита:

1. Означете четири 1.5 ml-ови колби както следва A+, A-, C+ и C-. Сложете 100 µl буферен реагент R4b (фосфатен буфер с pH 6.6) във всяка и добавете β-галактозидазен разтвор на R4a в колби A+ и C+ (но не и в A- или C-).
2. Добавете 100 µl от разтвор A в колби A+ и A- и 100 µl от разтвор C в колбите с означения C+ и C-.

Забележка: В следващите етапи от опита с всичките четири проби се работи по един и същ начин.

1. Загрейте всички проби за 30 min до 37 °C на водна баня докато започне хидролизата на лактозата.
2. След това добавете 1 ml дестилирана вода, 200 µl буферен реактив R1 и 50 µl реагент R2 (съдържащи съответно АТФ и НАДФ) към всички колби и разбъркайте добре.
3. Прехвърлете 1 ml от реакционната смес във фотометрични кювети и измерете оптичната плътност при 340 nm (OD₃₄₀) след 2 min.
4. Към всяка кювета добавете 7 µl ензимна смес R3, съдържаща хексокиназа и глюкозо-6-фосфат-дехидрогеназа, изчакайте още 5 min и отчетете отново абсорбцията при 340 nm.

Резултати и изводи

При първото отчитане при четирите проби се наблюдават ниски стойности на абсорбция, което означава липса на НАДФ.Н. Второто отчитане (след добавяне на ензимите) позволява разпознаването на разтвори А и С. Тъй като разтвор А дава положителна реакция без значение дали има добавена или не β-галактозидаза, може да се направи извод, че той съдържа глюкоза. За разлика от него промяна в абсорбцията на разтвор С се наблюдава само след добавянето на не β-галактозидаза, което означава, че той съдържа лактоза.

По време на упражнението учениците получават основни познания за заболяването и за проблемите, пред които са изправети болните от диабет. За измерване на нивото на глюкозата в кръвта си, пациентите използват тест-ленти, чийто принцип на действие е като този, описан в експеримент 2. Провеждането на такива опити може да привлече вниманието към диабета и как с болестта може да се живее или тя да бъде избегната чрез промяна в начина на живот.

Опитите, описани по-горе могат безопасно да бъдат провеждани в учебни лаборатории, тъй като реагентите не представляват опасни материали по смисъла на Регламента за опасните вещества (Регламент 67/548/EEC на ЕС). Количеството на натриев азид, консервантът в реагентите, е под минималното ниво според Директива 1999/45/EC.